• Le Gamberi Food

    Le Gamberi Food

Tumori

I tumori sono una delle cause di morte maggiori al mondo e anche una delle paure maggiori della nostra epoca. Anche se il consumo di carne rossa sembra essere collegato ad un aumento nello sviluppo di alcuni tipi di tumore, dall'altra parte vi sono dati sperimentali incoraggianti sull'utilizzo della dieta chetogenica come supporto nella terapia di alcuni tipi di tumore. Questo non deve sorprendere se pensiamo che la dieta chetogenica, se effettuata correttamente, simula alcuni aspetti del digiuno che si è visto essere efficace nel ridurre la tossicità della chemioterapia. Inoltre alcuni tumori utilizzano preferenzialmente il glucosio come scopo energetico e quindi i bassi livelli costanti di glicemia presenti durante una dieta chetogenica potrebbero avere un ruolo nel controllare la crescita delle masse tumorali.

Biblografia essenziale:

Chu-Shore CJ, Thiele EA. Tumor growth in patients with tuberous sclerosis complex on the ketogenic diet. Brain & development. 2010;32(4):318-322.

Klement RJ, Kammerer U. Is there a role for carbohydrate restriction in the treatment and prevention of cancer? Nutrition & metabolism. 2011;8:75.

Lee C, Raffaghello L, Longo VD. Starvation, detoxification, and multidrug resistance in cancer therapy. Drug resistance updates : reviews and commentaries in antimicrobial and anticancer chemotherapy. Feb-Apr 2012;15(1-2):114-122.

Maurer GD, Brucker DP, Bahr O, et al. Differential utilization of ketone bodies by neurons and glioma cell lines: a rationale for ketogenic diet as experimental glioma therapy. BMC cancer. 2011;11:315.

Scheck AC, Abdelwahab MG, Fenton KE, Stafford P. The ketogenic diet for the treatment of glioma: Insights from genetic profiling. Epilepsy research. 2011.

Schmidt M, Pfetzer N, Schwab M, Strauss I, Kammerer U. Effects of a ketogenic diet on the quality of life in 16 patients with advanced cancer: A pilot trial. Nutrition & metabolism. 2011;8(1):54.

Seyfried BT, Kiebish M, Marsh J, Mukherjee P. Targeting energy metabolism in brain cancer through calorie restriction and the ketogenic diet. Journal of cancer research and therapeutics. 2009;5 Suppl 1:S7-15.

Seyfried TN, Marsh J, Shelton LM, Huysentruyt LC, Mukherjee P. Is the restricted ketogenic diet a viable alternative to the standard of care for managing malignant brain cancer? Epilepsy research. 2011.

________________________________________________________________________________________________________________

Testo tradotto:

American Journal of Immunology 10 (1): 23-32, 2014

ISSN: 1553-619X

©2014 Science Publication

doi:10.3844/ajisp.2014.23.32 Published Online 10 (1) 2014 (http://www.thescipub.com/aji.toc)

 

ESPERIENZA CLINICA DI IMMUNOTERAPIA DEL CANCRO INTEGRATA CON ACIDO OLEICO COMPLESSATO CON PROTEINA LEGANTE VITAMINA D DEGLICOSILATA

 

1Emma Ward, 1Rodney Smith, 2Jacopo J.V. Branca,

3David Noakes, 2Gabriele Morucci and 1Lynda Thyer

1Macro Innovations Ltd, Cambridge, Regno Unito

2Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica, Università di Firenze, Firenze, Italia

3Immuno Biotech Ltd, Guernsey, Channel Islands

 

Ricevuto: 26/02/2014; Revisionato: 07/03/2014; Accettato: 08/03/2014

 

Abstract

 

Le proteine altamente rappresentate nel latte, come l’α-lattoalbumina e la lattoferrina si legano all’Acido Oleico (OA) per formare complessi con attività anti-tumorale selettiva. Una proteina presente nel latte, colostro e sangue, proteina che lega la vitamina D, è il precursore di un potente Fattore di Attivazione del Macrofago (GcMAF) e in analogia con altri complessi di proteina OA, abbiamo ipotizzato che OA-GcMAF potrebbe dimostrare una maggiore attività di immunoterapia rispetto a quella di GcMAF da solo. In questo lavoro descriviamo un'esperienza preliminare di trattamento dei pazienti con tumori avanzati, spesso etichettati come “incurabili", con un'immunoterapia integrativa centrata su OA-GcMAF. I pazienti con cancro avanzato sono stati trattati presso l’Immuno Biotech Treatment Centre con immunoterapia integrativa basata su OA GcMAF in combinazione con una dieta a contenuto molto basso di carboidrati, iperproteica, prodotti latticini fermentati contenenti GcMAF prodotto naturalmente, vitamina D3 e basse dosi di acido acetilsalicilico. Quando tumore primario o metastasi potevano essere misurati mediante tecniche ultrasonografiche, abbiamo osservato, in media, una diminuzione del volume del tumore di circa il 25% in una settimana. Abbiamo anche osservato un significativo aumento del flusso sanguigno splenico che è stato interpretato nel contesto dell'attivazione generalizzata del sistema immunologico e ha permesso di valutare il grado di reattività del singolo paziente. I risultati riportati qui sono coerenti con i risultati precedentemente descritti negli animali sperimentaliaffetti da carcinoma epatocellulare umano, nonché con i risultati riportati per la chemioterapia neoadiuvante. I complessi di proteina OA svolgono un ruolo guida nella terapia del cancro grazie alla selettività degli effetti antitumorali, all’assenza di eventuali effetti collaterali, alla sicurezza e alla disponibilità orale. Ipotizziamo che OA-GcMAF, combina gli effetti antitumorali noti dei complessi della proteina OA con i consolidati effetti della stimolazione immunitaria di GcMAF.

 

Parole chiave: GcMAF, Acido Oleico, cancro avanzato, immunoterapia integrativa, ultrasonografia

 

1. INTRODUZIONE

 

È stato confermato che le proteine altamente rappresentate nel latte come α-lattoalbumina e lattoferrina possono legare l’Acido Oleico (OA) per formare complessi con attività antitumorale altamente selettiva in vitro e in vivo (Fang et al., 2013). Recenti osservazioni sembrano indicare che OA gioca un ruolo chiave nell'azione tumoricida di tali complessi di proteina OA (Hoque et al., 2013).

Gli studi delle caratteristiche strutturali di questi complessi di proteina OA hanno mostrato una comune caratteristica che è la tendenza verso l'oligomerizzazione della proteina. Poiché l'oligomerizzazione indotta di OA è stata segnalata per altre proteine pure, si era ipotizzato che questo fenomeno fosse comune a molte proteine (Nemashkalova et al., 2013).

Alcune delle proteine del latte formano complessi di tumoricidi di proteina OA,come le lactoferrine, che sono potenti modulatori del sistema immunitario (Vogel, 2012), da cui si è avanzata l'ipotesi che il sistema immunitario è coinvolto negli effetti anticancro di complessi di proteina OA.

Oltre alle lactoferrine, un'altra proteina immunogenica altamente rappresentata nel latte, nonché nel colostro e nel sangue, è la proteina legante vitamina D. Questo è il precursore di un fattore di attivazione macrofago molto potente che deriva dalla sua deglicosilazione selettiva. Poiché la proteina legante la vitamina D è anche definita Gc-globulina, questo fattore di attivazione di macrofagi è noto come fattore di attivazione del macrofago derivato da Gc-globulina (GcMAF) (per la recensione sulla proteina legante della vitamina D e GcMAF, Ruggiero e Pacini, 2011).

I potenti effetti immunoterapici di GcMAF nei tumori umani sono stati dimostrati dal 2007 in una varietà di tumori che vanno dai più comune della mammella e della prostata fino al meno frequente oligodendroglioma (Yamamoto et al., 2008a; 2008b; 2008c; Inui et al., 2013; Thyer et al., 2013a; 2013b).

Pertanto, in analogia con altri complessi di proteina OA, abbiamo postulato che i complessi OA-GcMAF potrebbero mostrare un'attività antitumorale anche maggiore di quella di GcMAF da solo. Poiché i complessi di proteina OA e GcMAF non mostrano nessuna evidenza di tossicità (Ho et al., 2012; Bradstreet et al., 2012), questi complessi sono stati selezionati come parte di un approccio integrativo immunoterapico per i tumori avanzati nel contesto del cosiddetto approccio compassionevole. In questo studio, descriviamo le esperienze preliminari del trattamento dei pazienti con tumori avanzati, alcuni di essi considerati come “incurabili", con un'immunoterapia integrativa centrata su OA-GcMAF.

 

2. PAZIENTI E METODI

 

Presso l’Immuno Biotech Treatment Centre, i pazienti con cancro avanzato al 4 stadio avanzato, sono attualmente in trattamento con un'immunoterapia integrativa basata su OA-GcMAF. OA-GcMAF è stato usato in combinazione con una dieta a contenuto di carboidrati molto basso, iperproteica, nota per rallentare la crescita del tumore e prevenire l'iniziazione del cancro (Ho et al., 2011), i prodotti latticini fermentati contenenti GcMAF prodotto naturalmente, un alto supplemento di vitamina D3 (Den Hollander et al., 2013) e basse dosi di acido acetilsalicilico (Thun et al., 2012). Tutti questi approcci mirano a rafforzare e attivare il sistema immunitario e possono essere considerati complementari e non alternativi ad altre procedure terapeutiche anti-neoplastiche che i pazienti potrebbero voler prendere in considerazione.


2.1. OA-GcMAF

 

I complessi OA-GcMAF sono stati preparati "in-house" presso l’Immuno Biotech con una procedura coperta da brevetto. In breve, il GcMAF è stato purificato secondo la procedura precedentemente descritta (Yamamoto et al., 2008b). La proteina vitamina D è stata isolata dal siero umano purificato ottenuto dalla Croce Rossa americana, sia mediante cromatografia con alta affinità 25-idrossivitamina D3-sepharose, sia con actina-agarosio. Il materiale associato è stato eluito e poi ulteriormente elaborato tramite incubazione con tre enzimi immobilizzati come descritto (Bradstreet et al., 2012). Il GcMAF è stato ottenuto mediante filtrazione (sterilizzazione). Il contenuto proteico e la sua concentrazione è stato analizzato utilizzando metodi standard Bradford di dosaggio della proteina (Bradford, 1976). La purezza è stata valutata mediante analisi SDS-PAGE e Western Blot eseguita dopo ogni passaggio della procedura di preparazione; era visibile solo una banda di peso molecolare previsto (Smith et al., 2013). Alla fine del processo produttivo, il GcMAF è stato controllato per quanto riguarda la sterilità in-house ed esternamente da laboratori indipendenti. La sua sicurezza e attività biologica sono state testate nei monociti, nelle cellule del carcinoma mammario umano e nella Membrana corio-allantoidea dell’embrione del pulcino (Pacini et al., 2011; Pacini et al., 2012; Thyer et al., 2013 c). L’OA altamente purificato (peso molecolare, 282.46; formula molecolare, C18 H34 O2; Acros Organics, Geel, Belgio) è stato complessato con GcMAF secondo la struttura molecolare descritta in Thyer et al. (2013c). Le condizioni ottimali per la preparazione dei complessi sono state stabilite secondo i principi descritti in Knyazeva et al. (2008).

A causa del complessante della proteina con la frazione di acidi grassi idrofobi insieme alle note proprietà di OA come potenziatore di assorbimento, i complessi OA-GcMAF potrebbero anche essere somministrati via sublinguale (Cui et al., 2005; Sakata et al., 2011), come aerosol con un comune nebulizzatore (Lu et al., 2011), o supposte (Goto et al., 1991).

 

2.2. Valutazione degli effetti immunoterapeutici indotti da OA-GcMAF

 

L’attivazione macrofagica in vivo può essere valutata monitorando la pressione arteriosa del paziente prima e dopo la somministrazione di OA-GcMAF. Pertanto, è ben noto che i macrofagi attivati rilasciano Ossido Nitrico, un composto che provoca vasodilatazione e sembra essere responsabile di alcune delle proprietà anti-cancro dei macrofagi attivati (Stuehr e Nathan, 1989; Nathan e Hibbs, 1991; Hiroi et al., 2013). Si è costantemente osservata una piccola, ma significativa, diminuzione della pressione arteriosa sistolica e diastolica, per esempio da 137/84 a 122/71. Nella nostra esperienza, la somministrazione di OA-GcMAF (880 ng disciolto in soluzione salina da 5 ml) con un nebulizzatore ha provocato la più rapida diminuzione della pressione sanguigna con effetti chiaramente apprezzabili ad 1 min dopo la fine della nebulizzazione. Per avere un'altra valutazione della stimolazione immunologica, il flusso sanguigno splenico è stato monitorato con un sistema ad ultrasuoni (MyLab25Gold, Esaote, Genova, Italia) utilizzando la tecnica Eco Doppler Colore. Un aumento nel flusso sanguigno splenico periferico è stato costantemente osservato dopo la somministrazione di OA - GcMAF ed è durato per diversi giorni (fig. 1A e 1B).

 

2.3. Immunoterapia del cancro integrativa con OA-GcMAF

 

Il protocollo standard della nostra immunoterapia oncologica integrativa consiste di: OA-GcMAF (880 ng) è stato somministrato ogni giorno utilizzando la via di somministrazione che era considerata più adatta per ogni paziente, per esempio in pazienti con cancro del polmone o metastasi, la preferenza era somministrare OA-GcMAF con un nebulizzatore. In pazienti con cancro al fegato o metastasi, la preferenza era somministrarlo tramite supposte. In altri casi, la via intramuscolare, come originariamente proposta da Yamamoto et al. (2008a) era la via preferita.

 

2.4. Altri Approcci Integrativi Complementari

 

Al fine di sfruttare le proprietà sinergiche anti-cancro della vitamina D3 e tenendo presente che GcMAF costituisce parte dell'asse della vitamina D (Thyer et al., 2013 c), i pazienti hanno preso un supplemento nutrizionale di vitamina D3 a 20.000 UI al giorno (Den Hollander et al., 2013) ed è stato effettuato un monitoraggio dei livelli ematici di tale vitamina. Ai pazienti sono stati somministrati almeno 2 litri di acqua (o altri liquidi come le tisane) al giorno. I pazienti hanno seguito un regime nutrizionale basato sulle recenti osservazioni scientifiche che dimostrano che un bassissimo contenuto di carboidrati nell’ambito di una dieta iperproteica rallentano la crescita tumorale e prevengono l'insorgenza del cancro (Ho et al., 2011). Al fine di favorire la conformità con questo tipo di dieta, è stato fornito cibo aglucidico contenente solo il 2% di carboidrati e un contenuto proteico relativamente alto (Le Gamberi Foods, Forlì, Italia).

La massa muscolare ed il peso dei pazienti è stata monitorata ed è stato minimizzato l’Indice Nutrizionale di Infiammazione Prognostica (PINI)valori contenuti nei ranges al fine di evitare la sindrome cachessia anoressica oncologica (CACS), (Fabris et al., 2012). Anche per questo è stata effettuata una supplementazione di aminoacidi (Master Aminoacid Patter, International Nutrition Research Center, Coral Gables, FL, USA)(Lucà-Moretti et al., 2003).

tumori

Fig. 1. Flusso sanguigno splenico aumentato in seguito alla somministrazione di OA-GcMAF, Acido Oleico (OA) complessato con la vitamina D, proteina legante derivata dal fattore di attivazione del macrofago (OA-GcMAF, Goleic; Immuno Biotech Ltd, Guernsey, Channel Islands), 880 ng, disciolto in soluzione fisiologica da 5 mL è stato somministrato via nebulizzazione. Il flusso sanguigno splenico è stato valutato dalla tecnica ultrasonografica tecnica Eco Doppler Colore. Pannello A:un esempio di rilevazione basale prima di qualsiasi somministrazione di OA-GcMAF. Pannello B: 48 ore dopo la somministrazione di OA-GcMAF. L'aumento del flusso di sangue periferico splenico è evidente. Questa immagine è rappresentativa di molte altre che hanno dato risultati qualitativamente identici.

 

 

Infine, considerando il ruolo ben valutato di basse dosi di acido acetilsalicilico nella prevenzione del cancro (Thorat e Cuzick, 2013), i pazienti hanno ricevuto una dose di 100 mg al giorno.

 

3. RISULTATI

 

Alla fine dell’ ottobre 2013, i pazienti oncologici hanno iniziato il trattamento presso l’Immuno Biotech Treatment Centre utilizzando l'approccio integrativo OA-GcMAF sopra descritto. Entro la fine di febbraio 2014, Immuno Biotech aveva trattato 30 pazienti. Quando è stato possibile misurare con precisione il tumore primario o la metastasi con tecniche ultrasonografiche, è stata osservata in media una diminuzione del volume del tumore di circa il 25% in una settimana. Anche se tale riduzione può apparire eccessiva, è pienamente in accordo con i risultati riportati da Nonaka et al. (2012), che ha osservato una riduzione del volume del 97% del carcinoma epatocellulare umano dopo 3 settimane di iniezione sottocutanea di GcMAF. Queste osservazioni sonoinoltre coerenti con i risultati riportati per la chemioterapia neoadiuvante (Partridge et al., 2005).

Fra i pazienti osservati presso l’Immuno Biotech Treatment Centre, presentiamo qui alcuni casi, ciascuno come rappresentante di tumori comuni per i quali questa immunoterapia integrativa è stata notevolmente efficace. Secondo le nostre conoscenze, questo è il primo esempio di immagini reali di riduzione di volume del tumore dopo l’immunoterapia GcMAF. In effetti, finora l'efficacia dell’immunoterapia del cancro con GcMAF ha fatto affidamento su marcatori aspecifici come i livelli di siero dell’α-N-acetilgalattosaminidasi (Yamamoto et al., 2008a; 2008b; 2008c; Thyer et al., 2013a) o report aneddotici 2008c; Inui et al., 2013; Thyer et al., 2013a; 2013b).

 

Paziente 1

 

Ad una donna di 63 anni è stato diagnosticato un cancro al colon nel 1997. Una TC eseguita nell’aprile 2013 aveva confermato le metastasi nel polmone e nel fegato. La scansione del fegato ha segnalato una distorsione del fegato superiore ritenuta sospetta, dovuto a carcinomatosi pleurica (probabile invasione diaframmatica) ed anche una possibile invasione della superficie del fegato. Dopo 2 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF è stato somministrato alternativamente tramite nebulizzazione ed iniezioni intramuscolari, la lesione al livello del fegato, misurata con l’ultrasonografia, ha mostrato una diminuzione del suo diametro da 13 mm a 6,6 mm (Figg. 2A e B).

 

Paziente 2

 

Ad una donna di 62 anni è stato diagnosticato un mieloma multiplo. Dopo 4 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF è stato somministrato alternativamente via iniezioni intramuscolari, i monociti sono quasi raddoppiati (da 0.39 109/L a 0.70 109/L). Tale conclusione è coerente con l'osservazione originale secondo cui GcMAF stimola la produzione del midollo osseo delle cellule progenitrici per estensione della mitogenesi e per l’attivazione dei macrofagi, ricostituendo così il sistema immunitario (Yamamoto e Naraparaju, 1998). La stimolazione del sistema immunitario, in questo caso, potrebbe essere determinata anche dall'aumento dei linfociti che erano anomalmente bassi prima dell'immunoterapia integrativa (0,81 109/L) ed erano tornati a livelli normali in seguito (1,59 109/L). Il numero totale dei globuli bianchi era tornato normale (5.0 109/L), partendo da livelli precedentemente bassi (3,3 109/L). Anche il modesto aumento delle piastrine (da 187 a 201 109/L) deve essere interpretato come conseguenza dell’attivazione macrofagica e dei globuli rossi (da 3,31 a 3,48 1012/L). Infatti, è risaputo da molto tempo che l'Ossido Nitrico rilasciato da macrofagi attivati stimola l'ematopoiesi midollare (Iversen et al., 1994; Cokić e Schechter, 2008). Oltre al mieloma multiplo ed a prescindere da tale condizione, questa paziente ha avuto semplici cisti al seno visualizzate con l’ultrasonografia. Si è osservata una diminuzione significativa del diametro maggiore di una di queste cisti, che è stata presa come riferimento per le altre. Il diametro è diminuito da 5,4 a 3,8 mm (Figg. 3A e 3b). E’ risaputo che le cisti al seno, anche se non-maligne, si sviluppano quando una crescita eccessiva delle ghiandole e del tessuto connettivo blocca i dotti galattofori, causandone la dilatazione ed il riempimento con liquido (Guinebretière et al., 2005). Pertanto, gli effetti osservati dall'immunoterapia integrativa sulle dimensioni di questa ciste al seno sembrano indicare che tale approccio potrebbe essere efficace nel controllo della crescita cellulare anomala, anche quando questa non è palesemente maligna.

 

Paziente 3

 

Ad una donna di 43 anni è stato diagnosticato un cancro della mammella con metastasi ossee ed al fegato nel febbraio 2013. Dopo 1 settimana di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF è stato somministrato con iniezioni sottocutanee localizzate, il tumore primario a livello del seno, misurato con l’ultrasonografia ha mostrato una diminuzione del volume calcolato da 1,8 a 1,3 mL (Figg. 4A e B). Questo caso è rappresentativo di altri quattro casi di cancro al seno che qualitativamente hanno dato risultati simili.

 

Paziente 4

 

Ad un uomo di 60 anni è stato diagnosticato un cancro della tiroide con metastasiall'osso ed ai tessuti molli. Dopo 4 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF è stato somministrato alternativamente con nebulizzazioni ed iniezioni intramuscolari locali, una delle metastasi ossee presa come rappresentativa, misurata con l’ultrasonografia, ha mostrato una diminuzione del suo spessore da 43,3 mm a 37,3 mm (Figg. 5A e B).

tumori

Fig. 2. Ultrasonografia delle metastasi del fegato. Ad una donna di 63 anni è stato diagnosticato un cancro al colon nel 1997. Una TC eseguita nell’aprile 2013 aveva confermato le metastasi nel polmone e nel fegato. Dopo 2 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato alternativamente con nebulizzazioni ed iniezioni intramuscolari, la lesione a livello del fegato ha mostrato una diminuzione del suo diametro da 13 mm (pannello A) a 6,6 mm (pannello B). Ciò corrisponde a circa al 50% di riduzione complessiva.

tumori

Fig. 3. Ultrasonografia di una cisti al seno. Ad una donna di 62 anni è stato diagnosticato un mieloma multiplo. Dopo 4 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato con iniezioni intramuscolari, il diametro di una delle cisti benigne ha mostrato una diminuzione del suo diametro da 5,4 mm (pannello A) a 3,8 mm (pannello B). Ciò corrisponde per approssimazione al 65% della riduzione complessiva

tumori

Fig. 4. Ultrasonografia del cancro della mammella. Ad una donna di 43 anni è stato diagnosticato un cancro della mammella metastatico osseo ed al fegato nel febbraio 2013. Dopo 1 settimana di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF è stato somministrato con iniezioni sottocutanee localizzate, il tumore primario a livello del seno, misurato con l’ultrasonografia, ha mostrato una diminuzione del volume calcolato da 1,8 (pannello A) a 1,3 mL (pannello B). Ciò corrisponde a circa il 28% della riduzione complessiva. Questo caso è rappresentativo di altri quattro casi di cancro al seno che qualitativamente hanno dato risultati simili.

 

Paziente 5

 

Ad un uomo di 78 anni è stato diagnosticato un carcinoma renale metastatico. Dopo 2 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato alternativamente a nebulizzazioni ed iniezioni intramuscolari, una delle lesioni renali prese come rappresentative, misurata con l’ultrasonografia, ha mostrato una diminuzione del suo diametro da 33,7 mm a 29,8 mm (Figg. 6A e B).

 

Paziente 6

 

Ad un uomo di 36 anni è stato diagnosticato un melanoma metastatico. Dopo 1 settimana di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF è stato somministrato alternativamente con nebulizzazioni, una delle lesioni nell'addome, interpretata come noduli coalescenti metastatici peritoneali, misurata con l'ecografia, ha mostrato una diminuzione della sua lunghezza da 52.1 to 48.6 mm (Figg. 7A e B).

 

Paziente 7

 

Ad una donna di 55 anni è stata diagnosticato un adenocarcinoma metastatico del colon. Dopo 3 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF è stato somministrato alternativamente a nebulizzazioni ed iniezioni intramuscolari, una delle lesioni addominali interpretate come una delle metastasi precedentemente descritte, ha mostrato una diminuzione della sua lunghezza da 76,8 mm (pannello A) a 70,1 mm (Figg. 8A e B).

tuomori

Fig. 5. Ultrasonografia delle metastasi ossee. Ad un uomo di 60 anni è stato diagnosticato un cancro metastatico all'osso e ai tessuti molli della tiroide. Dopo 4 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato alternativamente con nebulizzazioni ed iniezioni intramuscolari locali. Una delle metastasi ossee prese come rappresentative, misurate con ultrasonografia, ha mostrato una diminuzione del suo spessore da 43,3 mm (pannello A) a 37,3 mm (pannello B). Ciò corrisponde ad una riduzione approssimativa del diametro lineare del 14%. In questo caso il volume potrebbe non essere completamente estrapolato dal momento che la massa ha mostrato una forma irregolare.

tumori

Fig 6. Ultrasonografia di metastasi renali. Ad un uomo di 78 anni è stato diagnosticato un carcinoma renale metastatico. Dopo 2 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato alternativamente a nebulizzazioni ed iniezioni intramuscolari, una delle lesioni renali presa come rappresentativa, misurata con l’ultrasonografia, ha mostrato una diminuzione del suo diametro da 33,7 mm (pannello A) a 29,8 mm (pannello B). Ciò corrisponde per approssimazione al 31% della riduzione complessiva

tumori

Fig. 7. Ultrasonografia di noduli addominali. Ad un uomo di 36 anni è stato diagnosticato un melanoma metastatico. Dopo 1 settimana di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato alternativamente a nebulizzazioni ed iniezioni intramuscolari, una delle lesioni dell’addome interpretate come noduli peritoneali metastatici coalescenti, misurata con l’ultrasonografia, ha mostrato una diminuzione della sua lunghezza da 52,1 mm (pannello A) a 48,6 mm (pannello B). Ciò corrisponde ad una riduzione approssimativa del diametro lineare del 7%. In questo caso il volume potrebbe non essere completamente estrapolato dal momento che la massa ha mostrato una forma irregolare

tumori

Fig. 8. Ultrasonografia della metastasi addominale. Ad una donna di 55 anni è stato diagnosticato un adenocarcinoma metastatico del colon. Dopo 3 settimane di immunoterapia integrativa, in cui OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato alternativamente a nebulizzazioni, iniezioni intramuscolari e supposte, una delle lesioni addominali interpretate come una delle metastasi precedentemente descritte, misurata con ultrasonografia, ha mostrato una diminuzione della sua lunghezza da 76,8 mm (pannello A) a 70,1 mm (Figg. 8A e B). Ciò corrisponde ad una riduzione approssimativa del diametro lineare del 9%. In questo caso il volume potrebbe non essere completamente estrapolato dal momento che la massa ha mostrato una forma irregolare

 

4. DISCUSSIONE

 

I complessi di proteina-OA sono tenuti svolgere un ruolo guida nella terapia del cancro, grazie alla selettività degli effetti antitumorali, all’assenza di eventuali effetti collaterali, alla sicurezza ed alla disponibilità orale.

La sintesi di OA-GcMAF combina gli effetti antitumorali noti dei complessi della proteina-OA con effetti anticancro della stimolazione immunitaria di GcMAF. In realtà, è risaputo che GcMAF, oltre ad attivare i macrofagi tumoricidi (Thyer et al., 2013 c), inibisce direttamente la proliferazione di cellule cancerogene (Gregory et al., 2010; Pacini et al., 2012) nonché come neo-angiogenesi indotta nelle cellule del cancro.

A causa dell'assorbimento naturale che aumenta l’attività di OA, il complesso OA-GcMAF rappresenta l’assemblaggio fisiologico del GcMAF naturale. Questa nuova formulazione permette a GcMAF di essere somministrato in una varietà di modi più desiderabili che eliminano gli ostacoli principali alla sua diffusione. Questa caratteristica favorisce un trattamento su misura per le caratteristiche individuali del paziente, con la possibilità di erogare il GcMAF - OA in distretti dove può meglio esercitare la sua azione.

 

Tavola 1. Illustrazione della diminuzione di volume del tumore (come calcolato da misurazione ultrasonografica), con i tipi di cancro trattati e il numero di settimane del trattamento al punto di misurazione

tumori

 

Siamo ben consapevoli che i casi clinici segnalati qui sono eterogenei e descrivono pazienti con diversi tipi di tumori in fasi diverse. In tutti i casi, i pazienti avevano subito una varietà di terapie convenzionali e complementari. In tutti i casi, l’immunoterapia integrativa è stata avviata alle ultime fasi della progressione del tumore, poiché è comprensibile che le terapie convenzionali sono state preferite nelle fasi precedenti. Inoltre, poiché questa è un analisi retrospettiva, non controllata, del tipo open-label, deve essere usata cautela quando si attribuiscono la causa e l’effetto per qualsiasi risultato del trattamento. Tuttavia, la risposta all’immunoterapia integrativa era forte (Tavola 1) e, anche se qualsiasi analisi statistica non è opportuna in una tale raccolta eterogenea di storie cliniche, l'assenza di effetti collaterali ed il miglioramento clinico supportato da evidenze oggettive emergono chiaramente.

 

5. CONCLUSIONE

 

A nostra conoscenza, le immagini ultrasonografiche qui presentate rappresentano la prima prova diretta che dimostra un effetto antitumorale di GcMAF negli esseri umani (in questo caso OA - GcMAF). Si evidenzia una significativa riduzione nella dimensione del tumore (Tavola 1) e sono pienamente in accordo con le immagini reali del restringimento del tumore indicato da Nonaka et al. (2012), che hanno segnalato gli effetti di GcMAF nelle cellule umane con epatocarcinoma umano trapiantate nei topi SCID. Le immagini ultrasonografiche mostrano anche un consistente aumento nel flusso del sangue splenico che deve essere interpretato nel contesto dell’attivazione generalizzata del sistema immunitario e permette di valutare quasi immediatamente il grado di reattività del singolo paziente. Pertanto, suggeriamo che l’imaging diagnostico piuttosto che misurazione di α-N-acetilgalactosaminidasi venga considetato come lo standard principale per valutare l'efficacia del trattamento GcMAF nei malati di cancro.

Anche se quasi tutti i pazienti si trovavano nella 4 fase avanzata, il requisito era che stessero sufficientemente bene per viaggiare ed essere abbastanza attivi per affrontare la residenza fuori sede durante il trattamento. Tutti questi pazienti hanno mostrato miglioramenti clinici significativi. I pazienti sono poi stati seguiti e controllati in modo più dettagliato in una data successiva.

 

5.1. Potenziali conflitti di interesse

 

DN è il CEO di Immuno Biotech, Ltd (l'azienda isola e purifica la proteina GcMAF). Tuttavia, DN non ha conoscenza delle terapie in uso, né dei nomi di tutti i pazienti di cui sono stati analizzati i dati. Né il CEO, né alcun dipendente di Immuno Biotech Ltd, hanno avuto alcuna conoscenza delle annotazioni cliniche e/o dei nomi dei pazienti usati in questo studio.

 

6. RIFERIMENTI

 

(Consultare il punto 6. REFERENCES del testo originale in inglese.)

_______________________________________________________________________________________________________________________________

Testo tradotto:

ANTICANCER RESEARCH 34: 3569-3578 (2014)

 

ACIDO OLEICO, PROTEINA VITAMINA D DEGLICOSILATA ED OSSIDO NITRICO: UNA TRIADE MOLECOLARE LETALE PER IL CANCRO

 

MARCO RUGGIERO1,4, EMMA WARD2, RODNEY SMITH2, JACOPO J.V. BRANCA3, DAVID NOAKES4, GABRIELE MORUCCI3, MARGIT TAUBMANN5, LYNDA THYER2 and STEFANIA PACINI3

 

1Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali e Cliniche, Università di Firenze, Firenze, Italia;

2Macro Innovations Ltd, Cambridge, UK;

3Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica, Università di Firenze, Firenze, Italia;

4Immuno Biotech Ltd, Guernsey, Channel Islands, Regno Unito;

5Naturheilzentrum, Bayreuth, Germania

 

 

Abstract. Sinossi: E’ stato dimostrato che l’Acido Oleico (OA) abbia proprietà antitumorali mediate dall'interazione con proteine come α-lattoalbumina e le lattoferrine. Pertanto, abbiamo sintetizzato complessi di OA e fattore attivante il macrofago Gc macrofago (GcMAF) derivato dalla proteina che inibisce la proliferazione delle cellule cancerogene e del potenziale metastatico per sé. Abbiamo ipotizzato che i complessi OA-GcMAF potrebbero sfruttare le proprietà anticancro di OA e di GcMAF in maniera sinergica. Abbiamo postulato che gli effetti stimolanti di GcMAF sui macrofagi potrebbero portare al rilascio di ossido nitrico (NO). Pazienti e metodi: I pazienti con cancro avanzato sono stati trattati presso l’Immuno Biotech Treatment Centre con immunoterapia integrativa basata su OA GcMAF in combinazione con una dieta a contenuto molto basso di carboidrati, iperproteica, con prodotti latticini fermentati contenenti GcMAF prodotto naturalmente, vitamina D3 e basse dosi di acido acetilsalicilico. Risultati: Misurando il tumore con tecniche ultrasonografiche, abbiamo osservato una diminuzione del volume del tumore di circa il 25%. Conclusione: Le presenti osservazioni dimostrano che OA, GcMAF e ossido nitrico possono essere correttamente combinati e specificamente consegnati ai pazienti con cancro avanzato con effetti significativi sulla stimolazione del sistema immunitario e sulla riduzione del volume del tumore, evitando effetti collaterali dannosi.

 

È risaputo che l'Acido Oleico (OA), un componente fondamentale prescritto nelle diete salutari (1), abbia proprietà anticancro (2) che contribuiscono all'aumento della longevità e alla riduzione del rischio di morbilità e mortalità associate al suo consumo (1). Anche se il preciso meccanismo molecolare responsabile della sua attività antitumorale non sia completamente compreso (2), sembra che l'OA sia coinvolto nel metabolismo del calcio intracellulare, ed abbia pertanto un ruolo chiavenell'induzione dell’apoptosi delle cellule tumorali.

È stato ipotizzato che l'effetto antitumorale di OA sia mediato dalla sua interazione con proteine altamente rappresentate nei liquidi biologici quali l’α-lattoalbumina e le lactoferrine. Queste proteine legano OA per formare la proteina OA che esibisce alta attività anti-tumorale selettiva in vitro ed in vivo (3). Subito dopo la loro identificazione, questi complessi sono stati etichettati come HAMLET, un acronimo che sta per "α-lattoalbumina umana resa letale per le cellule tumorali” (human α-lactalbumin made lethal to tumour cells), anche se ulteriori studi hanno dimostrato che l’α-lattoalbumina non è la sola proteina che forma tali complessi. Infatti, altre proteine, formando complessi con OA, mostrano identiche proprietà anticancro (4). È ormai accettato che questi complessi di proteina OA distruggono le cellule tumorali con alta selettività e con nessuna evidenza di tossicità per i tessuti sani, questa è una caratteristica fondamentale nella ricerca di trattamenti anticancro privi di effetti collaterali tossici.

Lo studio delle caratteristiche strutturali di tali complessi di proteina OA anticancro hanno dimostrato che una caratteristica molecolare comune è la tendenza verso l'oligomerizzazione della proteina indotta da OA. Poiché l'oligomerizzazione indotta da OA è stata segnalata per altre proteine pure, si era ipotizzato che questo fenomeno può essere inerente a molte altre proteine (Nemashkalova et al., 5).

Alcune delle proteine che formano complessi anticancro con la proteina OA come l’α-lattoalbumina e le lactoferrine sono altamente rappresentate nel latte. Questi composti sono noti per esercitare potenti effetti stimolatori sul sistema immunitario (6). Le lactoferrine, sono potenti modulatori del sistema immunitario (Vogel, 2012), quindi si può dare credito all'ipotesi che il sistema immunitario è coinvolto negli effetti anticancro dei complessi di proteina OA.

 

Inviare la corrispondenza a: Jacopo J.V. Branca, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica, Università di Firenze, Largo Brambilla 3, I-50134 Firenze, Italia. Tel: +39 0552758067, Fax: +39

0554379500, e-mail: jacopo.branca@libero.it

 

Parole chiave: Acido Oleico, Ossido Nitrico, macrofagi, cancro umano, vitamina D, fattore di attivazione macrofago derivato da proteina Gc.

 

 

Oltre alle lactoferrine, un'altra proteina immunogenica altamente rappresentata nel latte, nonché nel colostro e nel sangue, è la proteina legante la vitamina D. Questo è il precursore di un fattore di attivazione macrofago molto potente che deriva dalla sua deglicosilazione selettiva. Poiché la proteina legante la vitamina D è anche definita Gc-globulina, questo fattore di attivazione dei macrofagi è noto come GcMAF (Fattore di Attivazione Macrofago derivato da Gc-globulina) poiché presenta una proteina legante vitamina D e GcMAF, vedi riferimento bibliografico 7).

I potenti effetti immunoterapici di GcMAF nei tumori umani sono stati dimostrati dal 2007 in una varietà di tumori che vanno dai più comune alla mammella e prostata al meno frequente oligodendroglioma (8-14).

Pertanto, considerando che GcMAF lega OA in maniera identica a quella della α-lattoalbumina o della lactoferrina (15), abbiamo ipotizzato che i complessi OA-GcMAF erano dotati di attività antitumorale maggiore di quelli di OA o GcMAF solo quando si combinano le proprietà anticancro di GcMAF con quelli dei complessi proteina-OA. Poiché i complessi di proteina-OA e GcMAF non mostrano nessuna evidenza di tossicità (4, 16), un complesso di OA-GcMAF è stato usato come parte di un approccio integrativo di immunoterapia per tumori avanzati nel contesto del cosiddetto approccio compassionevole (14).

Nel presente studio abbiamo ipotizzato che gli effetti accentuati di OA-GcMAF nei pazienti a cui è stato recentemente diagnosticato un cancro (14) sono mediati dalla produzione di ossido nitrico (NO) con macrofagi attivati. Ciò identifica una triade di elementi molecolari, OA, GcMAF e NO, ognuno dotato di singole proprietà antitumorali, che dimostrano gli effetti sinergici e potrebbero aprire la strada ad una strategia di trattamento del cancro molto migliorata, priva di effetti collaterali.

 

Pazienti e metodi

 

Presso l’Immuno Biotech Treatment Centre, i pazienti con cancro avanzato sono attualmente in trattamento con un'immunoterapia integrativa basata su OA-GcMAF. I complessi OA-GcMAF sono usati in combinazione con i seguenti approcci: (i) un bassissimo contenuto di carboidrati, un elevato apporto proteico, dieta equicalorica che è nota per rallentare la crescita del tumore e prevenirne l’insorgenza (17), (ii) latticini fermentati contenenti GcMAF prodotto naturalmente, (iii) un alto supplemento di vitamina D3 (18), (iv) basse dosi di acido acetilsalicilico (19) e supplemento di acidi grassi Omega-3 (v) (20).

Tutti questi approcci mirano a rafforzare ed attivare il sistema immunitario e possono essere considerati complementari e non alternativi ad altre procedure terapeutiche anti-neoplastiche che i pazienti potrebbero voler prendere in considerazione.

 

Preparazione dei complessi OA-GcMAF. I complessi OA-GcMAF sono stati preparati “in-house" presso l’Immuno Biotech Ltd, con una procedura coperta da brevetto. In breve, il GcMAF è stato purificato secondo la procedura precedentemente descritta (Yamamoto et al., 2008b). La proteina legante della vitamina D è stata isolata dal siero umano purificato ottenuto dalla Croce Rossa americana Cross (2025 E St NW Washington, DC, USA), sia mediante cromatografia con alta affinità 25-idrossivitamina D3-sepharose sia mediante actina-agarosio. Il materiale associato è stato eluito e poi ulteriormente elaborato tramite incubazione con tre enzimi immobilizzati come già descritto (16). Il GcMAF risultante è stato sterilizzato con filtro. Il contenuto proteico e la sua concentrazione sono stati analizzati utilizzando metodi standard Bradford di dosaggio delle proteine (21). La purezza è stata valutata mediante analisi SDS-PAGE e Western Blot eseguita dopo ogni passaggio della procedura di preparazione; era visibile solo la banda di peso molecolare prevista (22). Alla fine del processo di produzione, GcMAF è stato controllato per quanto riguarda la sterilità in-house ed esternamente, da laboratori indipendenti. La sua sicurezza ed attività biologica sono state testate nei monociti umani, nelle cellule umane del carcinoma mammario umano e nella Membrana corio-allantoidea dell’embrione del pulcino (15, 23, 24). L’OA altamente purificato (peso molecolare, 282.46; formula molecolare, C18 H34 O2; Acros Organics, Geel, Belgio) è stato complessato con GcMAF secondo la struttura molecolare già descritta (15). Le condizioni ottimali per la preparazione dei complessi sono state stabilite secondo i principi descritti (25).

Grazie al complessante della proteina con la frazione di acidi grassi idrofobi insieme alle note proprietà di OA come potenziatore di assorbimento, i complessi OA-GcMAF potrebbero anche essere somministrati via sublinguale (26), come aerosol con un comune nebulizzatore (28), o transdermicamente (29).

 

Valutazione degli effetti dell’immunoterapia indotta da OA-GcMAF. L’attivazione macrofagica in vivo è stata valutata monitorando la pressione arteriosa del paziente prima e dopo la somministrazione di OA-GcMAF. Pertanto, è ben noto che i macrofagi attivati rilasciano ossido nitrico, un composto che provoca vasodilatazione e sembra essere responsabile di alcune delle proprietà antitumorali. La somministrazione di OA-GcMAF (440-880 ng disciolto in soluzione fisiologica da 5 ml) con un nebulizzatore, ha provocato la rapida diminuzione della pressione sanguigna con effetti chiaramente apprezzabili

1 minuto dopo la fine della nebulizzazione. Per avere un'altra valutazione della produzione di Ossido Nitrico e stimolazione immunologica, il flusso sanguigno splenico è stato monitorato con un sistema ad ultrasuoni (MyLab25Gold, Esaote, Genova, Italia) utilizzando la tecnica dell’Eco Doppler a colori.

 

Immunoterapia del cancro integrativa con OA-GcMAF. Il protocollo standard dell’Immuno Biotech Treatment Centre consiste in: OA-GcMAF (da 880 a 2.000 ng secondo le esigenze dei pazienti) è stato somministrato ogni giorno utilizzando la via di somministrazione più adatta per ogni paziente. Per esempio in pazienti con cancro del polmone o metastasi si è preferita la somministrazione di OA-GcMAF con un nebulizzatore; in pazienti con cancro al fegato o metastasi, la preferenza è stata la somministrazione tramite supposte;in altri casi, è stata utilizzata la via intramuscolare, come originariamente proposta da Yamamoto et al. (8).

 

Altri approcci integrativi complementari. Per sfruttare le note proprietà antitumorali della vitamina D3 e tenendo presente che il GcMAF è un componente dell'asse vitamina D (15), ai pazienti sono stati somministrati supplementi nutrizionali della vitamina D3, 20.000 IU al giorno (18), monitorando i livelli ematici di tale vitamina. I pazienti hanno ricevuto l’istruzione di bere almeno 2 litri di acqua (o altri liquidi come tisane) al giorno.

Ai pazienti è stato chiesto di seguire un regime nutrizionale basato sull'osservazione recente, dimostrando che un basso contenuto di carboidrati, associato ad una dieta iperproteica, rallenta la crescita tumorale e riduce notevolmente l’incidenza di cancro (17). Al fine di favorire la conformità a questo tipo di dieta, ai pazienti è stato fornito cibo contenente solo il 2% di carboidrati ed un contenuto proteico relativamente alto (Le Gamberi Foods, Forlì, Italia). Inoltre, per sfruttare le proprietà antitumorali note di OA contenute nell'olio extravergine d'oliva (32), ai pazienti è stato somministrato olio extra-vergine di oliva come parte cospicua della loro dose giornaliera di grasso.

La massa muscolare e il peso dei pazienti è stata monitorata e sono state insegnate loro le strategie per diminuire il Prognostic Inflammatory Nutritional Index (PINI), nonché per evitare la sindrome della cachessia anoressica del cancro (CACS) secondo Fabris et al. (33). Integratori di aminoacidi (Master Aminoacid Pattern, dr. reinwald healthcare gmbh, Schwarzenbruck, Germania) sono stati utilizzati per questo scopo (34). Anche la somministrazione di una bassa dose di acido acetilsalicilico e di olio extravergine d'oliva sono stati destinati a ridurre l'infiammazione sistemica e, quindi, a ridurre il valore PINI (35).

Al fine di sfruttare i noti effetti antitumorali e di stimolazione del sistema immunitario e gli effetti antitumorali probiotici dei latticini fermentati (36), ai pazienti è stato datoun prodotto di latte fermentato probiotico contenente colostro e microrganismi noti per produrre GcMAF naturale dal latte e colostro Gc-globulina, durante il processo di fermentazione (Bravo probiotico, Les Alpes, Wellington, Nuova Zelanda). Infine, considerando il ruolo ben definito della bassa dose di acido acetilsalicilico nella prevenzione del cancro (37), i pazienti ne hanno ricevuto una dose di 100 mg al giorno.

 

Risultati

 

È stato dimostrato che OA-GcMAF stimola macrofagi (15) che a loro volta rilasciano ossido nitrico (30). Considerando gli effetti noti dell’ossido nitriconitrico in modelli preclinici di cancro in cui rallenta la crescita tumorale e migliora l'efficacia della chemioterapia e della radioterapia (38), in primo luogo abbiamo cercato di determinare se OA-GcMAF stimola il rilascio di ossido nitriconitrico da macrofagi in vivo. A tal fine, abbiamo scelto di studiare la variazione di pressione arteriosa sistolica e diastolica e del flusso sanguigno splenico, dopo la somministrazione di OA-GcMAF (880 ng in soluzione fisiologica di 5 ml) tramite nebulizzazione. Secondo la nostra ipotesi, OA-GcMAF stimolerebbe macrofagi alveolari che a loro volta produrrebbero ossido nitriconitrico, abbassando così la pressione sanguigna. OA-GcMAF verrebbe in seguito assorbito dal flusso ematico ed eventualmente stimolerebbe macrofagi in altre zone del corpo. Considerando l'enorme quantità di macrofagi residenti nella milza (39), ci si aspetterebbe un massiccio rilascio di ossido nitriconitrico da macrofagi attivati in questo organo, con un concomitante aumento del flusso sanguigno, da misurare facilmente con Eco Doppler a colori.

In un soggetto con lieve immunodeficienza dovuta a noduli multipli della tiroide (soggetto del test # 1; Figure 1 e 2), a cui p stato auto-somministrato OA-GcMAF (880 ng in soluzione fisiologica da 5 ml) tramite nebulizzazione per circa 5 min, si è osservato che circa 1 minuto dopo la fine della nebulizzazione, la pressione sanguigna rilevata da seduto è diminuita da 124/85 a 115/74. Un effetto qualitativamente simile è stato osservato nella maggior parte dei soggetti a cui è stato somministrato OA-GcMAF per nebulizzazione e la diminuzione media è dell'ordine di 10 mm Hg. Abbiamo interpretato questi risultati come prova indiretta della produzione di ossido nitrico con macrofagi alveolari attivati da OA-GcMAF. In realtà, è ben risaputo che l’Ossido Nitrico diminuisce la pressione sanguigna negli esseri umani, nonché neglianimali (40, 41). La Figura 3 mostra l’aspetto ultrasonografico della milza del soggetto #1 prima della nebulizzazione; la morfologia della milza, le dimensioni e la struttura ultrasonografica appaiono normali. Il flusso sanguigno splenico potrebbe essere apprezzato in corrispondenza dell’ilo della milza. Si può osservare soltanto un segnale basso o assenza di segnale nel parenchima dell'organo. La figura 4 mostra il flusso di sangue splenico a 5 min (pannello A) e ad 1 ora dopo la nebulizzazione (pannello B). L'aumento del flusso di sangue periferico splenico è evidente. Abbiamo interpretato questo aumento del flusso sanguigno del parenchima come una conseguenza dell'attivazione macrofagica intra-splenica con il rilascio di ossido nitrico che era a sua volta responsabile della dilatazione dei vasi sanguigni periferici e dell’ilo. Questo effetto è durato per almeno 48 ore. La Figura 5 raffigura il flusso sanguigno splenico 24 ore (pannello A) e 48 ore (pannello B) dopo la nebulizzazione. Si noti che il soggetto del test #1, a differenza dei pazienti bona fide, non ha subito alcun trattamento GcMAF correlato né associato alle strategie complementari descritte sopra.

L'affidabilità e la riproducibilità del metodo è stata valutata in base alla reattività dei pazienti rispetto alla somministrazione di OA-GcMAF. Un effetto simile, anche se molto più lento nel suo sviluppo, è stato osservato in pazienti in cui OA-GcMAF è stato somministrato tramite iniezioni sottocutanee localizzate. La figura 6 mostra l'aumento del flusso sanguigno splenico osservato dopo 7 giorni di trattamento in un paziente con carcinoma mammario metastatico e coinvolgimento del nodo del retro-sterno, in cui il complesso OA-GcMAF (1.320 ng/giorno) è stato somministrato tramite iniezioni sottocutanee localizzate nella parete addominale (epigastrio, 880 ng) e nel cavo ascellare (440 ng).

L’attivazione dei macrofagi alveolari e splenici con somministrazione del complesso OA-GcMAF e conseguente rilascio di ossido nitrico è stata associata ad una diminuzione significativa del volume tumorale in tutti i casi in cui tumore primario, metastasi o linfonodi avrebbero potuto essere misurati mediante tecniche ultrasonografiche. In media, abbiamo osservato una diminuzione del volume del tumore di circa 25% in una settimana (14). Anche se tale riduzione può apparire accentuata, è pienamente in accordo con i risultati riportati da Nonaka et al. (42), il quale ha osservato una riduzione del volume del 97% del carcinoma epatocellulare umano dopo 3 settimane di iniezioni sottocutanee con GcMAF. Essa è inoltre coerente con i risultati riportati per la chemioterapia neoadiuvante (43). Questi risultati aggiungono un supporto all'ipotesi che OA, GcMAF ed ossido nitrico, molecole singolarmente dotate di proprietà antitumorali hanno come obiettivo diversi aspetti della crescita neoplastica e forniscono un'indicazione di un effetto sinergico quando somministrati in modo da sfruttare le loro caratteristiche fisiologiche.

Tra i casi osservati presso l’Immuno Biotech Treatment Centre, presentiamo quelli di due pazienti, ciascuno esemplificativo di tumori comuni, per i quali l'immunoterapia integrativa basata su OA, GcMAF e ossido nitrico è stata

tumori
Figura 1. I risultati ultrasonografici del soggetto del test #1: l’ultrasonografia della tiroide, la scansione assiale del lobo inferiore destro. A. noduli solidi leggermente sporgenti di 1,17 cm nella parte anteriore del lobo inferiore. La struttura interna ultrasonografica è finemente disomogenea, ipo-riflettente in confronto al tessuto circostante normale della tiroide. I margini sono ben definiti. B. Doppler a colori del nodulo stesso. I vasi sanguigni sono situati intorno al nodulo solido nel tipico aspetto di "cesto". C. Una lesione più piccola (0,7 cm), prevalentemente liquida (ipo-riflettente), con un altro piccolo nodulo solido nelle vicinanze (freccia bianca). All'interno della lesione ipo-riflettente, può essere notata un'area sporgente di tessuto solido. D. Ultrasonografia Doppler a colori della stessa lesione. I vasi sanguigni sono situati nei dintorni delle due lesioni.

 

 

notevolmente efficace. A nostra conoscenza, questo è uno dei pochi esempi di immagini reali di riduzione di volume del tumore dopo l'immunoterapia con GcMAF. Così, finora l'efficacia dell’immunoterapia del cancro con GcMAF si affida ad indicatori non specifici quali i livelli sierici di α-N-acetilgalattosaminidasi (8-10, 12) o rapporti aneddotici (11, 13).

 

Paziente 1. Ad un uomo di 56 anni è stato diagnosticato un carcinoma di cellule squamose metastatiche, precedentemente trattate con diversi cicli di radioterapia e chemioterapia. Dopo un periodo di remissione, sono state rilevate diverse nuove metastasi, tra cui una nei tessuti molli della parete addominale destra. Inoltre, il paziente ha mostrato difficoltà di respirazione, probabilmente a causa delle metastasi che ostruiscono i bronchi e che impedivano la ventilazione del suo lobo apicale di destra. A causa di questi sintomi, OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato con un nebulizzatore, contenente 440 ng del principio attivo disciolto in 5 ml di soluzione fisiologica e con iniezioni sottocutanee localizzate (440 ng) nella parete addominale di destra in prossimità della lesione sottocutanea indicata dal paziente e facilmente riconoscibile dall’ultrasonografia. Il paziente non ha segnalato alcun effetto avverso seguendo queste vie di somministrazione che sono state scelte con il suo consenso informato. L’ultrasonografia della lesione nella parete addominale di destra è stata effettuata pervalutare le modifiche.

tumori
Figura 2. I risultati ultrasonografici del soggetto del test #1: l’ultrasonografia della tiroide, la scansione longitudinale del lobo inferiore sinistro. A. Può essere osservato un nodulo massiccio misto sporgente (solido e cistico) che sostituisce per gran parte il lobo. Il diametro antero-posteriore è di circa 3 cm, mentre il diametro longitudinale è maggiore della lunghezza della sonda (4 cm). La struttura è grossolanamente disomogenea con aree cistiche ed aree ipo-riflettenti alternate con aree iso-riflettenti o iper-riflettenti. I margini che confinano con il tessuto tiroideo normale residuo osservabile sulla destra della figura (freccia bianca, porzione craniale del lobo sinistro) appaiono ben definiti. Il bordo ipo-riflettente potrebbe indicare un'area di edema circostante il nodulo. B. Doppler a colori del nodulo stesso. I vasi sanguigni sono situati attorno e all’interno del nodulo. Vale la pena notare che pochi o nessun vaso sanguigno possono essere osservati nelle aree ipo-riflettenti (indicate dai cerchi bianchi tratteggiati) suggerendo la presenza di tessuto tumorale metabolicamente inattivo.

 

 

tumori
Figura 3. L’aspetto ultrasonografico della milza del soggetto del test #1 prima della somministrazione di OA-GcMAF. Pannello A: Morfologia, dimensione e struttura ultrasonografica della milza sembrano normali. Pannello B: Il flusso sanguigno splenico potrebbe essere apprezzato in corrispondenza dell’ilo della milza. Si sono osservati segnale basso o assente nel parenchima dell'organo.

 

 

Tenendo presente che le misurazioni effettuate sulle immagini ultrasonografiche possono essere influenzate da un certo numero di variabili, le prove preliminari sembrano indicare che queste lesioni, prese come rappresentative, hanno mostrato una riduzione del loro volume calcolato da ml 0,30 a ml 0,22 (circa il 27%) dopo 5 giorni di trattamento (Figura 7). Il paziente ha riportato un miglioramento soggettivo della respirazione ed è stata migliorata la ventilazione nel lobo apicale di destra.

 

Paziente 2. Ad una donna di 62 anni è stato diagnosticato un vasto cancro al seno con il coinvolgimento di linfonodi ascellari diffusi. La paziente ha scelto di non sottoporsi ad intervento chirurgico o ad altri trattamenti convenzionali fin dalla diagnosi iniziale. Poiché la dimensione del tumore primitivo era maggiore della sonda (4 cm), abbiamo optato per la misurazione dei nodi ascellari coalescenti al fine di monitorare la risposta al complesso OA-GcMAF. OA-GcMAF (880 ng/giorno) è stato somministrato con un nebulizzatore

tumori
Figura 4. Immediato aumento del flusso sanguigno splenico dopo somministrazione di OA-GcMAF con nebulizzazione nel soggetto del test #1. Il flusso sanguigno splenico è stato valutato dalla tecnica ultrasonografica Eco Doppler Colore. Pannello A: Flusso sanguigno splenico 5 min dopo la fine della nebulizzazione con OA-GcMAF. Pannello B: Flusso sanguigno splenico 1 ora dopo la fine della nebulizzazione. L'aumento del flusso di sangue periferico splenico è evidente.

 

 

tumori
Figura 5. Aumento continuo del flusso sanguigno splenico dopo somministrazione di OA-GcMAF con nebulizzazione nel soggetto del test #1. Il flusso sanguigno splenico è stato valutato dalla tecnica ultrasonografica Eco Doppler Colore dopo la somministrazione di OA-GcMAF. Pannello A: Flusso sanguigno splenico 24 ore dopo la fine della nebulizzazione. Pannello B: Flusso sanguigno splenico 48 ore dopo la fine della nebulizzazione. L'aumento del flusso di sangue nel parenchima sembra persistente

 

 

tumori
Figura 6. L’aumento del flusso sanguigno splenico dopo la somministrazione di OA-GcMAF mediante iniezione sottocutanea localizzata in un paziente malato di cancro. Il flusso sanguigno splenico è stato valutato dopo la somministrazione di OA-GcMAF con la tecnica ultrasonografica Eco Doppler Colore. Pannello A: Sangue splenico prima della somministrazione. Pannello B: Flusso sanguigno splenico dopo 7 giorni di somministrazione. L'aumento del flusso di sangue nel parenchima è evidente.

 

 

tumori
Figura 7. Ultrasonografia della metastasi dei tessuti molli prima e dopo la somministrazione di OA-GcMAF. Paziente 1. A un uomo di 56 anni è stato diagnosticato un carcinoma con cellule squamose metastatiche, precedentemente trattate con diversi cicli di radioterapia e chemioterapia. Dopo un periodo di remissione, sono state rilevate diverse nuove metastasi, tra cui uno nei tessuti molli della parete addominale destra. Pannello A: Aspetto ultrasonografico della lesione prima della somministrazione di OA-GcMAF. Pannello B: Aspetto ultrasonografico della lesione prima della lesione dopo 4 giorni consecutivi di OA-GcMAF. Può essere stimata una riduzione di volume approssimativamente del 27%.

 

 

tumori
Figura 8. Ultrasonografia dei linfonodi ascellari neoplastici prima e dopo la somministrazione di OA-GcMAF. Paziente #2: A una donna di 62 anni è stato diagnosticato un vasto cancro al seno con il coinvolgimento di linfonodi ascellari diffusi. Sono stati misurati noduli ascellari coalescenti ipsilaterali. Dopo 4 giorni consecutivi di trattamento di OA-GcMAF, il diametro dei due noduli ascellari coalescenti è stato ridotto da 3,90 (pannello A, cioè prima del trattamento) a 3,46 cm (pannello B, cioè dopo 4 giorni di trattamento). In termini di volume teorico calcolato, si ipotizza che la lesione era sferica, ciò corrisponde a una riduzione di circa il 28%.

 

 

contenente 440 ng di principio attivo disciolto in 5 ml di soluzione fisiologica e con iniezioni sottocutanee localizzate (440 ng) nell’ascella, 1 cm distalmente ai noduli individuati dall’ultrasonografia. Il paziente non ha segnalato alcun effetto avverso seguendo queste vie di somministrazione che sono state scelte con il suo consenso informato. La Figura 8 Mostra che dopo 4 giorni di trattamento il diametro dei due nodi ascellari coalescenti si è ridotto da 3,90 a 3,46 cm. In termini di volume teorico calcolato, si ipotizza che la lesione fosse sferica, il che corrisponde ad una riduzione di circa il 28%.

 

Discussione

 

OA, GcMAF e ossido nitrico sono molecole dotate di molteplici attività biologiche che possono essere sfruttate nelle strategie di trattamento antitumorale. L’effetto killer tumorale selettivo dei complessi della proteina OA come HAMLET è attribuito ad OA che, una volta trasportato all'interno delle cellule tumorali grazie alla sua associazione con le proteine, attiva il metabolismo apoptotico delle cellule tumorali. Questi includono l’interferenza con l'espressione di oncogeni (Ras, erbB-2 e c-Myc) e con l’enzima glicolitico (2, 4). In questo scenario, la proteina serve principalmente, se non unicamente, come veicolo per trasportare OA all'interno della cellula tumorale, dove l'acido grasso può avere come bersaglio la membrana citoplasmatica, il citoscheletro, i mitocondri, i proteasomi, i lisosomi ed il nucleo (4). Inoltre, un recente studio ha dimostrato che le attività biologiche dei complessi OA-α-lattoalbumina risiedono nell’acido grasso. Inoltre, il gruppo α-lattoalbumina non ha un effetto killer sul tumore stesso, ma semplicemente agisce come un agente solubilizzante per OA (44).

Pertanto, la sintesi dei complessi di OA-GcMAF potrebbe rappresentare un vantaggio su HAMLET, poiché GcMAF, a differenza dell’α--lattoalbumina, esercita un effetto diretto sulle cellule tumorali. In particolare, grazie al nostro lavoro ed a quello di altri gruppi, è stato dimostrato che GcMAF inibisce la proliferazione di cellule cancerogene ed il potenziale metastatico (24, 45). In altre parole, i complessi OA-GcMAF potrebbero sfruttare le proprietà antitumorali di OA e di GcMAF, possibilmente in maniera sinergica. In questo scenario, OA favorirebbe il legame del complesso alla membrana citoplasmatica, come già dimostrato (15) ed il complesso multi-molecolare del recettore (VDR) OA-GcMAF-vitamina D dovrebbe essere interiorizzato. Una volta all'interno della cellula, OA e GcMAF potrebbero indirizzare le loro rispettive vie metaboliche e di segnalazione, inducendo rapidamente l’apoptosi delle cellule tumorali.

Infatti, abbiamo recentemente osservato che i complessi OA-GcMAF sono circa 200 volte più potenti di GcMAF da solo nell'induzione dell’apoptosi in vitro delle cellule del cancro al seno (Thyer L, et al., comunicazione personale dei dati sperimentali presentati al XVIII International Meeting della Società Europea di Ginecologia Oncologica, Liverpool, Regno Unito, ottobre 2013), probabilmente a causa di questo effetto sinergico.

Se questa ipotesi è corretta, potrebbe aiutare a spiegare gli effetti diretti dei complessi di OA-GcMAF su cellule tumorali; gli effetti stimolatori distinti del GcMAF sui macrofagi potrebbero essere responsabili della sintesi e del rilascio di una terza molecola antitumorale, vale a dire ossido nitrico. Così, abbiamo dimostrato che gli effetti del GcMAF sono mediati da VDR (15, 46), e l'attivazione VDR conduce alla sintesi ed al rilascio di ossido nitrico da parte dei macrofagi (47). Nella nostra osservazione, la sintesi ed il rilascio di ossido nitrico dopo la somministrazione di OA-GcMAF potrebbero essere ricondotti alla diminuzione della pressione sanguigna ed all’aumento del flusso di sangue splenico(vedi la sezione "Risultati").

Gli effetti antitumorali dell’ossido nitrico sono conosciuti da molti anni (30) e sembra che OA ed ossido nitrico condividano gli obiettivi comuni alle cellule tumorali. Così, l’ossido nitrico sopprime la respirazione cellulare e la sintesi del DNA ed induce l'apoptosi delle cellule del cancro attivando le proteasi della famiglia della caspasi, una caratteristica in comune con OA (2, 48). Più interessanti dal punto di vista dell'applicazione clinica sono gli effetti convergenti di OA ed ossido nitrico sul cammino glicolitico delle cellule del cancro (49, 2).

In accordo con l'ipotesi della glicolisi come bersaglio primario di OA e senza effetti antitumorali, è stato dimostrato che la privazione di glucosio sensibilizza le cellule tumorali alla morte delle cellule indotte da HAMLET (50). Infatti, questa osservazione è stata alla base di uno dei principi dell’approccio antitumorale integrativo sopra descritto, che è il piano nutrizionale a basso contenuto di carboidrati. Infatti, abbiamo riflettuto sul fatto che la dieta a basso contenuto di carboidrati non priverebbe solo le cellule tumorali della loro unica fonte di energia (17), ma inoltre le renderebbe più sensibili agli effetti anticancro di OA ed ossido nitrico.

In conclusione, le osservazioni presentate in questo studio, insieme ai risultati delle recenti modellizzazioni molecolari (15), dimostrano che OA, GcMAF ed ossido nitrico, molecole dotate di proprietà antitumorali individuali, possono essere correttamente combinate e specificamente somministrate ai pazienti con cancro avanzato con effetti significativi sulla stimolazione del sistema immunitario e riduzione del volume del tumore. Infatti, ad eccezione dei 40 pazienti sottoposti ai criteri di accettazione dell’Immuno Biotech Treatment Centre, per lo più con tumori di stadio 4 avanzato, tutti hanno mostrato miglioramenti clinici significativi e comparabili. Queste osservazioni possono rivoluzionare il campo del trattamento del cancro, poiché sembra che le strategie antitumorali proposte sono completamente prive di effetti collaterali nocivi riportati.

 

Potenziali conflitti di interesse

 

DN è il CEO di Immuno Biotech, Ltd (l'azienda che isola e purifica la proteina GcMAF). Tuttavia, DN non ha conoscenza delle terapie in uso, né dei nomi di tutti i pazienti i cui dati sono stati analizzati. Né il CEO, né alcun dipendente di Immuno Biotech Ltd, avuto alcuna conoscenza delle annotazioni cliniche o dei nomi dei pazienti usati in questo studio. MR è il direttore scientifico consulente di Immuno Biotech, Ltd ed è professore ordinario di biologia molecolare che ha contribuito all'interpretazione della modellistica molecolare ed ai risultati descritti.

 

Riconoscimenti

 

Stefania Pacini ha ricevuto sovvenzioni dall'Università di Firenze e dal progetto PRIN 2009.

 

Riferimenti

 

(Consultare il punto References del testo originale in inglese.)

 

Ricevuto: 23 aprile 2014

Revisionato: 26 maggio 2014

Accettato: 27 maggio 2014

_______________________________________________________________________________________________________________________________

IXth International Conference of Anticancer Research

Testo tradotto:

tumori
LE GAMBERI FOODS srl | 4, Corso Diaz - 47121 Forlì (FC) - Italia | P.I. 03338350402 | Tel. +39 0543 33455 | info@legamberi.it | Informazioni legali | Privacy | Cookie Policy | Sitemap
Powered by  Pagine Gialle  -  SmartSite